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绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制The expressi

发布时间:2021-12-25 点击数:

  绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制The expression mechanism of thamnaconusseptentrionalis sex steroid hormone receptor in the reproductive cycle of the.pdf

  绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制The expression mechanism of thamnaconusseptentrionalis sex steroid hormone receptor in the reproductive cycle of the.pdf

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  万方数据 谨以此论文献给我敬爱的导师温海深教授,李吉方老师和 何峰老师,献给我的父亲、母亲和家人,献给所有帮助、 支持和关心过我的人! 赵梅琳 万方数据 万方数据 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 摘 要 绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis )是我国的重要经济鱼类,本研究以烟 台百佳水产公司人工养殖的绿鳍马面鲀为研究对象,对其进行为期一年的周期采 样。运用免疫组织化学和性类固醇激素放射免疫测定法,对绿鳍马面鲀的性腺和 血清性类固醇激素进行了深入研究和分析,并采用分子生物学方法对绿鳍马面鲀 性类固醇激素受体进行了基因克隆与表达分析,得出结果与结论如下: 1 绿鳍马面鲀性腺的免疫组织化学观察 对绿鳍马面鲀进行为期一年的隔月采样。对绿鳍马面鲀性腺中雌激素受体α (ERα )和雄激素受体(AR )进行了定位,发现在卵巢、精巢发育的不同阶段 均存在两种受体的不同程度的表达。在卵巢中,ERα 在卵母细胞早期发育阶段呈 强的免疫阳性反应,而随着卵母细胞的成熟,AR 免疫反应逐渐增强,这都说明 雌激素及其受体对卵巢发育早期阶段起着关键作用,但雄激素及其受体对卵巢的 作用机制尚不明确;精巢中的ERα 和AR 在精子发生各个时期的间质细胞处均 有强阳性反应,在生殖细胞处ERα 较AR 有更高水平的表达,这说明雌激素及 其受体对精巢的发育成熟起到关键作用,雄激素及其受体对生殖细胞的发育、成 熟和维持也起着重要作用。 2 绿鳍马面鲀ERs 基因的克隆与时空表达分析 本实验首次克隆到绿鳍马面鲀三种 ERs 基因:ERα cDNA 核心序列共 1410bp,编码470 个氨基酸;ERβ1 cDNA 全长2192bp ,包含一个开放阅读框, 编码565 个氨基酸;ERβ2 cDNA 全长2363bp ,包含一个开放阅读框,可以编码 662 个氨基酸。利用生物学软件将绿鳍马面鲀ERs 的氨基酸序列与其它硬骨鱼类 及哺乳动物等进行多序列比对,发现了 ERs 的一些共有的结构特点,也发现了 绿鳍马面鲀ERs 的一些特点。本实验采用RT-PCR 方法,检测了ERs 在性成熟 雌、雄鱼中11 种组织中的分布情况,结果表明,绿鳍马面鲀ERs 在雌鱼各组织 I 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 中较雄鱼的表达更广泛,包括一些非生殖组织,如鳃、肾脏和脾脏等都检测到 mRNA 表达,特别是绿鳍马面鲀ERβ1 只在雄鱼性腺组织中检测到表达,其他组 织均未检测到表达信号。此外,结合血清E 、T 及GSI 的周年变化,对ERs 在 2 性腺中的周年表达情况进行了分析,发现绿鳍马面鲀ERs 与血清E2 和GSI 都呈 现出一定的相关性,这表明E2 和ERs 可能影响性腺的发育成熟。 3 绿鳍马面鲀AR 基因的克隆与时空表达分析 本实验首次克隆到绿鳍马面鲀AR 部分基因序列,得到AR cDNA 核心序列 共769bp ,共编码256 个氨基酸。利用生物学软件将该片段推导得到的氨基酸序 列与其它硬骨鱼类及哺乳动物等进行多序列比对,发现了该序列结构上的一些特 点。本实验采用RT-PCR 方法,检测了AR 基因在性成熟雌、雄鱼 11 种组织中 的分布情况,结果表明,该基因在雄鱼各组织中均有表达,仅在雌鱼的一些组织 中检测到表达信号,且在雄鱼各组织中的表达丰度高于雌鱼,并认为AR 与ARβ 更为接近。此外,结合血清T 分析了AR 在性腺组织中的周年变化情况,发现该 基因的转录水平与繁殖周期和血清T 的含量存在密切关系。 关键词:绿鳍马面鲀;性腺;性类固醇激素;ER ;AR II 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 The expression mechanism of the sex steroid hormones receptors during the reproductive cycle in Navodon septentrionalis Abstracts: Navodon septentrionalisis considered as one of the most economic marine fishes in China. This paper takes Navodon septentrionalis which cultured in Baij ia fishery company (Yantai, Shandong province) as an experimental fish. The period of the whole experiment is one year. In this study, the gonadal tissue, sexual steroid hormone of serum and expression patterns of sexual steroid hormone receptores in Navodon septentrionalis are study by immunohistochemical and radioimmunoassay and biochemical methods in details. The results are as follows: 1. Immunohistochemical study on the gonads of Navodon septentrionalis The samples were collected every two month for a year. Then gonad sampled and used to study the immunohistochemical to locate the estrogen receptor α (ERα) and androgen receptor (AR). The results showed that the gonads at different stages exhibit immunopositive reaction in varying degrees to the two receptors. In ovary, in the early period of oocytes, it shows strong immunopositive reaction to ERα antibodies. With the oocyte mature, the immunopositive reaction to AR antibodies increased gradually. These results demonstated that estrogen and its receptor play a crucial role in the early development of ovarian, while we know little about the mechanism of androgen and its receptor to ovary development . In testis, interstitial cell shows strong immunopositive reaction to the two receptors, whereas reproductive cells show stronger immunopositive reaction to ERα than AR which indicate that estrogen and its receptor make a critical difference in testis development. This also may indicate that androgen and its receptor stimulate germ cell development, mature and maintain. 2. Molecular cloning and expression analysis of estrogen receptor III 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 (ERs) in Navodon septentrionalis In this experiment, three estrogen receptors are isolated from ovary of Navodon septentrionalis. The length of ERα partial cDNA sequence is 1410 base pairs [bp], and encodes 470 amino acids; the full-length cDNA of ERβ1 and ERβ2 consist of 2192bp and 2363bp, respectively, including an open reading frame encoding deduced protein of 565 and 662 amino acid residues. Biological softwares are used to compare the three cloned ERs sequences with that of other ERs and some structure identities are found in these sequences. In this paper, the tissue distribution of ERs mRNA in Navodon septentrionalis is examined using RT-PCR. The results show that the three ERs mRNA are present in most tissue of adult female fishes including some non-reproductive tissue like gill, kidney and spleen, while they have a restricted distribution in males. Particularly, except for the testis, it is undetectable in other for ERβ1 in males. In addition, we analyzed the relative expression level of ERs in reproductive cycle in ovary and testis by quantitative RT-PCR together with GSI and serum E2 and T, and ERs mRNA expression pattern appear to be gonad development stage-dependent and related to the serum E2 throughout the annual reproductive cycle. These results indicate that E2 and its receptor can stimulate gonads development and mature. 3. Molecular cloning and expression analysis of androgen receptor (AR) in Navodon septentrionalis The androgen receptoris isolated from ovary of Navodon septentrionalis for the first time. The length of AR partial cDNA sequence is 769bp, and encodes 256 amino acids. Biological softwares are used to compare the AR sequence with that of other AR and some structure identities are found in these sequences. In this paper, the tissue distribution of AR mRNA in Navodon septentrionalis is examined using RT-PCR. The results show that the AR mRNA is present in all tissues of adult male fishes, whereas it has a restricted distribution in females, being more abundant in males. The AR is considered more closely to ARβ than ARα. In addition, we analyzed the relative expression level of AR in reproductive cycle in ovary and testis by qRT-PCR together IV 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 with serum T, and AR mRNA expression pattern appear to be gonad development stage and serum T-dependent throughout the annual reproductive cycle. Key words :Navodon septentrionalis ; gonad; Sex steroid hormones; ER; AR V 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 目录 中英文缩略词表VIII 前言 1 第一章 文献综述3 1.绿鳍马面鲀研究概况3 1.1 绿鳍马面鲀的生物学特征3 1.2 绿鳍马面鲀国内外研究现状4 2.硬骨鱼类性腺发育的周年变化研究5 2.1 卵巢发育分期5 2.2 精巢发育分期6 3.性类固醇激素及其受体的研究进展7 3.1 鱼类性类固醇激素的生成部位及其作用7 3.2 雌激素受体研究进展8 3.3 雄激素受体研究进展 10 4.本研究的目的和意义 11 第二章 绿鳍马面鲀雌激素受体α 和雄激素受体在性腺组织中的定位 12 1.材料与方法 12 1.1 实验用鱼 12 1.2 样品采集 12 1.3 主要仪器和试剂 13 1.4 实验方法 13 2.结果 14 2.1 绿鳍马面鲀雌激素受体α 在性腺组织中的定位 14 2.2 绿鳍马面鲀雄激素受体在性腺组织中的定位 19 3.讨论23 4.小结24 第三章 绿鳍马面鲀三种雌激素受体基因的克隆与时空表达分析25 1.材料与方法25 1.1 实验用鱼26 1.2 样品采集26 1.3 实验主要仪器和试剂26 1.4 绿鳍马面鲀总RNA 的提取和cDNA 的合成27 1.5 绿鳍马面鲀ERs 基因克隆与表达引物设计27 1.6 绿鳍马面鲀ERs 基因的克隆28 1.7 序列分析和系统进化树的构建29 1.8 绿鳍马面鲀ERs 基因的组织表达和周年表达29 1.9 绿鳍马面鲀血清E 、T 的激素测定29 2 2.结果30 2.1 绿鳍马面鲀ERα cDNA 核心序列的克隆30 2.2 绿鳍马面鲀ERα 基因序列分析与系统进化分析30 2.3 绿鳍马面鲀ERα 的组织表达33 2.4 绿鳍马面鲀不同性腺发育期中ERα 的周年变化34 VI 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 2.5 绿鳍马面鲀ERβs cDNA 全长序列的克隆35 2.6 绿鳍马面鲀ERβs 基因序列分析与系统进化分析37 2.7 绿鳍马面鲀ERβs 的组织表达41 2.8 绿鳍马面鲀不同性腺发育期中ERβs 的周年变化42 2.9 GSI 的周年变化43 2.10 绿鳍马面鲀血清中E 、T 的周年变化44 2 3.讨论45 3.1 绿鳍马面鲀ERα 基因结构与进化分析45 3.2 绿鳍马面鲀ERα mRNA 的时空表达分析45 3.3 绿鳍马面鲀ERβs 基因结构与进化分析47 3.4 绿鳍马面鲀ERβs mRNA 的时空表达分析47 4.小结49 第四章 绿鳍马面鲀雄激素受体基因的克隆与时空表达分50 1.材料与方法50 1.1 实验用鱼50 1.2 样品采集50 1.3 实验主要仪器和试剂50 1.4 绿鳍马面鲀总RNA 的提取和cDNA 的合成50 1.5 绿鳍马面鲀AR 基因克隆与表达引物设计51 1.6 绿鳍马面鲀AR 基因的克隆51 1.7 序列分析和系统进化树的构建51 1.8 绿鳍马面鲀AR 基因的组织表达和周年表达51 1.9 绿鳍马面鲀血清E 、T 的激素测定52 2 2.结果52 2.1 绿鳍马面鲀AR cDNA 序列的片段克隆52 2.2 绿鳍马面鲀AR 基因序列分析与系统进化分析52 2.3 绿鳍马面鲀AR 的组织表达55 2.4 绿鳍马面鲀不同性腺发育期中AR 的周年变化55 3.讨论56 4.小结58 参考文献59 致谢69 VII 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 中英文缩略词表 AF-1 非配体依赖的转录激活功能区(activation function 1 ) AF-2 配体依赖的转录激活功能区(activation function 1 ) E2 17β-雌二醇(17β-Estradiol ) GnRH 促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone ) GtH 促性腺激素(Gonadotropic hormone ) HPG 下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamus- Pituitary- Gonad ) GSI 性腺成熟系数(Gonadosomatic index ) Mean ±SE 平均值±标准误(Mean ±standard error ) RIA 放射免疫测定方法(Radioimmunoassay ) T 睾酮(Testosterone ) RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction ) RACE cDNA 末端快速扩增法(Rapid amplification of cDNA ends ) ER 雌激素受体(Estrogen receptor ) AR 雄激素受体(Androgen receptor ) PKA 蛋白激酶A (Protein kinase A ) PKC 蛋白激酶C (Protein kinase C ) ERE 雌激素应答元件(Estrogen responsive element ) MAPK 丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases ) FSH 促滤泡激素(Follicle-stimulating hormone ) LH 促黄体激素(Luteinizing hormone ) 11-KT 11-酮基(氧)睾酮(11-Ketotestosterone ) LBD 配体结合区(Ligand-binding domain ) DND DNA 结合区(DNA-binding domain ) GPCRs G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors ) SABC 链霉亲和素-生物素复合物(Strept Avidin-Biotin Complex ) cpm 每分钟计数(Counting per minute ) VIII 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 前 言 脊椎动物的下丘脑-垂体-性腺(HPG )轴能使机体感受外界刺激,调节生理 机能,是重要的生殖调控系统。硬骨鱼类的生殖内分泌同样受HPG 轴的调控。 当鱼体受到温度、光周期、食物等外界刺激时,其感觉器官将这一信号传送到脑, 并促使下丘脑分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone , GnRH ),激发垂体分泌促性腺激素(gonadotropic hormone,GtH ),刺激性腺分 泌性类固醇激素,从而促使性腺发育成熟,并产生排精、排卵等活动。由外界刺 激引发的鱼类周期性生殖发育,发挥主要作用的是GnRH,GtH 和性类固醇激素 的调控。因此,研究性类固醇激素及其受体周期性变化情况,对硬骨鱼类生殖生 理的研究具有重要意义。 硬骨鱼类中的性类固醇激素主要包括雌激素(雌二醇,E )、雄激素(睾酮, 2 T )、17-α-20β-二羟孕激素(孕酮,DHP )等(林浩然,1999;施瑔芳,1991; 刘筠,1993),在刺激性腺发生、发育、成熟、维持第二性征和性行为方面发挥 重要作用 (林浩然等,1994)。雌激素和雄激素需要与其受体结合才能发挥作用, ERs 和AR 作为其重要的核受体一直受到人们的关注。 绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis )属鲀形目(Tetraodontiformes )革鲀 科(Aluteridae ),马面鲀属(Navodon ),英文名Bluefin leatherjacket ,俗称面包 鱼、象皮鱼、马面鱼等 (孟宪菊等,2009 )。主要分布于日本、朝鲜半岛,非洲 东岸,南非以及我国的东海、黄渤海和台湾海峡,其中东海是我国绿鳍马面鲀产 量最大的海区 (李平伦等,2003 )。20 世纪80 年代以前,绿鳍马面鲀是我国海 洋捕捞居第二位的重要经济鱼类 (陈莲芳等,1984)。近些年,由于自然海域资 源严重衰退,加之肉质鲜嫩,肝脏营养价值高,绿鳍马面鲀的市场价格明显提高, 绿鳍马面鲀冻鱼片、烤鱼片等诸多产品畅销国内外,市场前景十分广阔 (孟宪菊 等,2009 )。近年来,我国陆续开展了对绿鳍马面鲀的研究工作,特别是对人工 养殖和胚胎发育相关的报道日益增多,其人工繁育方面已取得一些进展。目前国 内外对绿鳍马面鲀繁殖生理学特别是繁殖相关基因的报道仍不多见。 本文以人工养殖性成熟绿鳍马面鲀为对象,以繁殖相关基因,如ERs 和AR 的克隆和时空表达为研究重点,结合这两种受体在性腺中的定位情况和血清性类 1 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 固醇激素水平的周年变化情况进行分析,揭示这两种受体在绿鳍马面鲀雌鱼、雄 鱼繁殖周期中的生理作用,在理论上丰富硬骨鱼内分泌研究内容,在实践上为绿 鳍马面鲀的生殖调控和繁育提供科学依据。 本研究得到山东省科技攻关计划课题 (2009GG资助。 2 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 第一章 文献综述 脊椎动物的下丘脑-垂体-性腺(HPG )轴能使机体感受外界刺激,调节生理 机能,是重要的生殖调控系统。硬骨鱼类的生殖内分泌同样受HPG 轴的调控。 当鱼体受到温度、光周期、食物等外界刺激时,其感觉器官将这一信号传送到脑, 并促使下丘脑分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone , GnRH ),激发垂体分泌促性腺激素(gonadotropic hormone,GtH ),刺激性腺分 泌性类固醇激素,从而促使性腺发育成熟,并产生排精、排卵等活动。由外界刺 激引发的鱼类周期性生殖发育,起主要作用的是GnRH,GtH 和性类固醇激素的 调控。因此,研究性类固醇激素及其受体周期性变化情况,对硬骨鱼类生殖生理 的研究具有重要意义。 1.绿鳍马面鲀研究概况 绿鳍马面鲀(Navodon septentrionalis )又名Thamnaconus septentrionalis (Gunther,1877)属于鲀形目(Tetraodontiformes )革鲀科(Aluteridae ),马面 鲀属(Navodon ),英文名Bluefin leatherjacket ,俗称面包鱼、象皮鱼、马面鱼等 (孟宪菊等,2009 )。主要分布于日本、朝鲜半岛,非洲东岸,南非以及我国的 东海、黄渤海和台湾海峡,其中东海是我国绿鳍马面鲀产量最大的海区(李平伦 等,2003 )。 图1-1 绿鳍马面鲀整体外观图 Fig1-1The overall appearance of Navodon septentrionalis 1.1 绿鳍马面鲀的生物学特征 3 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 (1)形态学特征:绿鳍马面鲀的整体外观如图1-1,其体侧扁,呈长椭圆形; 口小,吻长,鳃盖小,鳃孔长,眼靠近背缘;皮为革质,通体蓝灰色,体侧有大 小不等的深灰色斑,鳞小,无侧线;第一背鳍退化为一根尖硬的鳍棘,第二背鳍 成臀鳍对应,两腹鳍于腰带末端退化为一短棘,不能活动,胸鳍较小,呈圆形, 尾鳍圆形,为深绿色(李明德,1998;孟宪菊等,2009 )。 (2 )生活习性:绿鳍马面鲀是温水性底层鱼类,喜栖于深色高盐水中,常 栖于岩礁海区。生长适宜温度为13-25 ℃,适宜盐度为33.5-35 ;产卵最适温度范 围较广(16-25 ℃),且耐低氧能力较强(不低于4mg/L )。绿鳍马面鲀较为迟钝, 对声音不敏感,不善游泳,但具洄游习性。其个体有大小分群的现象,喜集群。 绿鳍马面鲀属于杂食性鱼类,摄食种类多,以摄食桡足类、端足类等浮游动物为 主,对饵料的选择性不强,具有较强的适应性(孟宪菊等,2009 ;李平伦等,2002 )。 (3 )繁殖特性:绿鳍马面鲀一般2 龄可达性成熟,此时体长一般在为 150mm 以上,产卵群体体长约为180-280mm ,最大可达340mm 。产卵期较长,东海海 域的绿鳍马面鲀产卵期一般在3 月下旬至5 月中旬(郑元甲,1987),黄渤海海 域的产卵期为4 月中上旬至6 月下旬(温海深等,2010 ),属于非同步分批产卵 类型的鱼类(孟宪菊等,2009 )。 (4 )经济价值:绿鳍马面鲀肉质坚实,味道鲜美,加之营养丰富,蛋白质 含量高,还可加工成鱼绒或鱼糜制品、烤鱼片、冻鱼片等,品种丰富,加之产量 较高,一直深受人们的欢迎,其市场前景十分广阔。 1.2 绿鳍马面鲀国内外研究现状 绿鳍马面鲀一直为我国的重要经济鱼类,据调查,20 世纪80 年代以前,绿 鳍马面鲀是我国海洋捕捞居第二位的重要经济鱼类(陈莲芳等,1984)。然而近 年来,由于过度捕捞和生态破坏引发其产卵场被破坏,导致其自然资源严重衰退 (陈丕茂等,2000 ;孟宪菊等,2009 ),现已不能满足国内外市场的需求,导致 市场价格明显提高。近些年,我国陆续开展了对绿鳍马面鲀的研究工作,特别是 对人工养殖和胚胎发育相关的报道日益增多。詹秉义等(1986)评估了绿鳍马面 鲀的现存资源量并对开发模式进行了探讨;丁民权(1994)对绿鳍马面鲀在东海 的分布情况进行了分析;李平伦等(2002 ,2003 )报道了绿鳍马面鲀的海上网箱 养殖技术要点,推动了人工养殖绿鲀马面鲀的实现;陈莲芳等(1984)、关键等 4 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 (2011 )、温海深等(2010 )对绿鳍马面鲀从胚胎到仔稚鱼的发育过程做了详细 描述;温海深等(2010 )从繁殖生物学方面绿鳍马面鲀性腺组织做了比较系统的 研究;Gen-Bo 等(2010 )实现了绿鳍马面鲀的微卫星标记;此外,张冬茜等(2013 ) 首次从分子生物学角度对阐述了绿鳍马面鲀的繁育过程。这些成果大大推进了我 国绿鳍马面鲀的人工养殖进程,丰富了绿鳍马面鲀人工育苗与养殖技术,为科学 养殖绿鳍马面鲀提供了重要的科学参考依据。 2.硬骨鱼类性腺发育的周年变化研究 由于种和种群的特异性,不同鱼类繁殖季节及持续时间的差异,致使产卵季 节和产卵类型存在差异(张培军,1999)。根据性腺发育周期的不同,按卵子发 生模式,一般把卵巢分为三种类型:完全同步型卵巢,即卵巢中所含的卵母细胞 都处于同一发育阶段,这种鱼通常一生只产卵一次就死亡;部分同步型卵巢,是 指卵巢中至少同时含有两种不同发育阶段的卵母细胞;非同步型卵巢,即卵巢内 同时含有各个发育阶段的卵母细胞,这些鱼一般生殖季节较长,且能进行多次产 卵 (施瑔芳,1991)。研究显示,绿鳍马面鲀即为非同步型分批产卵的鱼类(孟 宪菊等,2009 )。 2.1 卵巢发育分期 目前对于性腺发育分期,国际上还没有统一的标准。我国学者大多沿用前苏 联学者MeйeH 的方法(MeйeH ,1939 ),将硬骨鱼类的卵子发生与卵巢发育对应 起来,分为6 个时相,1 时相卵母细胞-卵原细胞时相;2 时相卵母细胞-单层滤 泡时相;3 时相卵母细胞-卵黄颗粒出现时相;4 时相卵母细胞-卵黄充满时相;5 时相卵母细胞-卵母细胞成熟时相;6 时相卵母细胞-退化吸收时相,卵巢对应于 Ⅰ-Ⅵ,共6 个时期 (刘筠,1993)。 I 期卵巢:为一对透明的线状细丝,用肉眼不能辨别雌雄。生殖细胞主要是 卵原细胞和由卵原细胞向初级卵母细胞过渡的细胞,呈微酸性反应,伊红染色后 呈淡红色。这一时期的卵巢只存在于未达到性成熟的低龄个体中。 II 期卵巢:卵巢扁平透明,呈肉红色,可与精巢区分,但肉眼尚看不清卵粒。 此时生殖细胞以初级卵母细胞为主,可能存在少量卵原细胞或少量2 时相卵母细 胞开始向3 时向过渡,卵母细胞不断增大,细胞质嗜碱性。为未达性成熟的个体 或性成熟个体产后恢复阶段所具有。 5 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 III 期卵巢:卵巢淡黄或青灰色,血管密布且粗大,卵粒肉眼可见。生殖细 胞含部分1 时相和2 时相的卵母细胞,但以3 时相的卵母细胞为主,其主要特点 是营养物质逐渐沉积,出现放射膜和液泡,滤泡细胞发展为两层。此时细胞质仍 嗜碱性,细胞核核质嗜酸性,核仁清晰可见。 IV 期卵巢:卵巢呈淡黄色,体积显著增大,卵粒较大且易脱落。生殖细胞 以4 时相卵母细胞为主,如果是非同步产卵类型同时存在一定数量的3 时相卵母 细胞。4 时相卵母细胞中,卵黄颗粒逐渐增多,放射带增厚,呈现嗜酸性。此时 达到生长成熟,开始向生理成熟过渡。 V 期卵巢:卵巢呈淡黄色,较松软,提起鱼体或轻压腹部即有成熟卵粒排出。 如果是同步产卵类型此期卵巢内存在大量的2 、3、4 时相卵母细胞,含有部分5 时相卵母细胞。此时相是卵母细胞达到生理成熟的阶段,其主要特点是核膜溶解, 核仁消失,形成卵黄板。 VI 期卵巢:为排完卵后的卵巢。此时卵巢表面血管萎缩充血,卵巢萎瘪, 体积变小。此期卵巢以后转变为Ⅱ期。分批产卵的鱼,卵巢内仍存在2 时相、3 时相卵母细胞,经一段时间发育后又继续产卵,故此类卵巢经短期恢复后直接由 Ⅲ期变为Ⅳ期。 2.2 精巢发育分期 按照生精细胞的排列方式的不同,硬骨鱼精巢一般分为小叶型和小管型,小 叶型,即精巢中精小囊为精小叶的结构单位,除精原细胞位于精小叶边缘外,其 它生精细胞都处于精小囊中,同一精小囊内生精细胞基本处于同一发育阶段,待 生精细胞发育成熟后,精小囊破裂,精子进入小叶腔内;小管型性腺由许多定向 排裂的小管组成,小管都通向中央腔,精原细胞只位于小管的盲端 (Billard , 1986)。目前的研究显示,大多数硬骨鱼精巢都属于小叶型结构。绿鳍马面鲀精 巢亦属于典型的小叶型结构(温海深等,2010 )。 鱼类精细胞的发育比较简单,其发育过程为:精原细胞→初级精母细胞→次 级精母细胞→精子细胞→精子,共5 个发育阶段,精巢按组织学也可分为6 个时 期。 I 期精巢,即精原细胞生长期,与Ⅰ期卵巢相似,用肉眼不能辨别雌雄,也 是只存在于未达到性成熟的低龄个体中。 6 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 II 期精巢为精原细胞增殖期,呈细线状,半透明或不透明,肉眼可以区分雌 雄。此期,精原细胞较多,成束,之间被结缔组织所间隔。 III 期精巢为精母细胞成熟期,由于血管分布,呈现肉红或淡黄色。生殖细 胞以初级精母细胞为主,且含有少量的精原细胞。此时精细小管开始出现管腔。 IV 期精巢,即精子细胞变态期,呈乳白或灰白色,表面血管明显。此期的 精小叶以次级精母细胞为主,同时含有部分初级精母细胞和精子细胞。此时精巢 进入成熟期。 V 期精巢即为生殖期,呈乳白色,表面的血管更加明显。轻压鱼腹会有大量 白色精液流出。从组织切片上可见大量的次级精母细胞和精子细胞,同时精细小 管的管腔和壶腹充满成熟的精子。 VI 期精巢,即为退化吸收期,体积显著缩小,外观萎瘪。经恢复后转为Ⅲ 期精巢。 3.性类固醇激素及其受体的研究进展 3.1 鱼类性类固醇激素的生成部位及其作用 在脊椎动物中,脑可通过性类固醇激素的正负反馈作用,调节内分泌水平, 改变生理状态,被称为HPG 轴调控,这与繁殖发育息息相关(Kah 等,1997; De Leeuwd 等,1986)。Schoonen 等(1997)发现,不同物种的不同发育阶段, 性腺生成类固醇激素的能力不同,进而促进性腺的发育成熟。研究表明,硬骨鱼 类中的性类固醇激素主要包括雌激素,如雌二醇 (E )、雌三醇、黄体酮等,雄 2 激素,如睾酮 (T )、雄烯二酮等、孕激素,如孕酮 (17α-羟孕酮、17α,20β-双羟 孕酮等)(林浩然,1999;施瑔芳,1991;刘筠,1993),其生理作用主要表现在 刺激性腺发生、发育、成熟和维持;刺激第二性征和性行为的发生;对脑和垂体 进行反馈调节,并维持机体的正常机能(林浩然等,1994;李文笙等,2000 ;赵 会宏等,2003 )。 Schoonen 等(1987b)发现,雌二醇可由卵巢细胞和卵泡内膜层产生,其含 量的变化可以反映卵巢发育水平。此外,非洲鲶(Clarias gariepinu)等(Richter , 1987)的研究表明血清E2 与性腺发育息息相关,随着卵黄的积累,血清E2 也不 断上升。目前很多研究显示,在雄性的繁殖发育过程中,E2 对也有着重要作用。 日本鳗鲡(Anguilla japonica )(Miura 等,1999,2001 ,2003 )的研究表明,精 7 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 原细胞增殖和支持细胞的生理活动都与E2 密不可分。研究表明,E2 与雄激素密 不可分,雄激素是E2 前身物,而T 对脑和垂体的作用需要E2 的间接调节。在硬 骨鱼中,11-酮基睾酮(11-KT )和T 对精子发生也起着重要作用(Schulz 等,1999 )。 鱼类精巢和卵巢的体细胞主要作用是为发育的生殖细胞供营养物质、分泌和 提供合适的激素环境。卵巢滤泡中两种体细胞层——膜细胞层和颗粒细胞层,在 性类固醇激素的生成过程中的作用各不相同(Hoar 等,1978;Nagahama 等,1982), 膜细胞层中含有生产雄激素及其前体所必须的酶,颗粒细胞层虽然不能分泌类固 醇激素,但可在芳香化酶的催化下,将T 转化为E2 (Nagahama ,1997)。研究发 现,精巢的间质细胞、足细胞和支持细胞是分泌性类固醇激素的主要部位,其中 间质细胞与哺乳动物的支持细胞(Leydig cell )同源,主要分泌雄激素 (洪万树 等,2001 ;Gresik 等,1973;张耀光等,1993 );足细胞也具有分泌性类固醇激 素的机能;支持细胞主要产生类固醇激素合成酶,如 P450scc ,P450c17 和 3β- 羟类固醇脱氢酶等。虽然在精巢组织中并不能经常检测到芳香化酶,但是有证据 显示在精巢发育的一些阶段存在 E2 的分泌 (Kobayashi 等,1998;Morrey 等, 1998;Nagahama ,1999)。这些研究结果都表说明了E2 和 T 在雌鱼、雄鱼的生 长、发育及繁殖中都是必不可少的,而类固醇激素相对含量的多少是性别决定的 关键所在。 3.2 雌激素受体研究进展 雌激素是一种重要的性类固醇激素,是参与脊椎动物的繁殖过程,促进性腺 发育和成熟。此外,雌激素同样对中枢神经系统(Martinez 等,2010 )、免疫系 统(Karas 等,1994;Krust 等,1986)、糖代谢(Rodrigo 等,2006 )、脂代谢(Condeelis 等,1995)以及血管功能(Pfaffl 等,2004 )等方面有重要影响。研究表明,雌 激素在体内的重要生理功能是由雌激素受体(Estrogen receptor ,ER )介导的, 包括核受体介导的基因组效应和膜受体介导的非基因组效应(Edwards ,2005 ; Levin ,2009 ;Thomas 等,2006 )。前者为经典的 ERs,是核受体超家族成员之 一,主要依赖类固醇激素核受体家族成员,与配体结合后,其构象发生改变,激 活雌激素调控基因转录从而发挥作用。后者主要是通过 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs )家族的GPR30 发挥作用(Carmeci 等,1997)。 ERs 蛋白的分子结构大致划分为六大功能结构域(A-F ),这一结构是核受体 8 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 超家族成员的显著特征,主要包括 (1)N-端的A/B 区为转录激活区,其保守性 较低,各ERs 亚型间的同源性也较低;(2 )C 区为DNA 结合区(DNA-binding domain,DBD ),该区保守性较强,有由8 个保守的半胱氨酸残基组成的两个锌 指结构,主要介导受体与靶基因相结合;(3 )D 区为铰链区,具有高度可变性, 便于受体的构象发生改变,从而使受体二聚化并与DNA 相结合;(4 )E 区为配 体结合区 (Ligand-binding domain ,LBD ),该区最为保守,内含一个配体依赖的 转录激活区AF-2 ,主要参与与配体的结合;(5 )位于C-端的F 区,该区长度范 围变化较大,其功能尚不明确 (Krust 等,1986)。 国内外的研究表明,雌激素受体在哺乳动物中仅存在两种基因亚型,分别为 雌激素受体α (ERα )和雌激素受体β (ERβ ),它们分别由不同基因所编码,并 具有不同的组织表达模式(Enmark 等,1999;Choi,2003 )。然而,近年来对硬 骨鱼类的研究报道了上述两种亚型的变体,如在虹鳟(Oncorhynchus mykiss ) (Nagler 等,2000 )、金鱼(Carassius auratus )(Choi 等,2003 )、倒刺鲃(Spinibarbus denticulatus )(Zhu 等,2008 )等硬骨鱼类中均发现了四种ERs 亚型,分别为erα1, erα2,erβ1 和erβ2,而在斑马鱼(Danio rerio )(Menuet 等,2002 )、尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus)(Wang 等,2005 )、许氏平鲉(Sebastes schlegeli )(Shi 等,2011 )等硬骨鱼类中均只发现三种ERs (erα,erβ1 和erβ2 ),目前比较公认 的假说认为,硬骨鱼类雌激素受体亚型的产生,是辐鳍鱼类同肉鳍鱼类分开进化 之后,由辐鳍鱼类全基因组复制造成的(Amores 等,1998;Ma ,2000 ;Nagler 等,2007 )。 鉴于雌激素受体的重要生理功能,越来越多的研究对其进行了报道。研究发 现,雌激素受体的不同亚型分别由不同基因编码,且组织分布也不尽相同。在哺 乳动物中,ERα 主要分布于子宫、脑垂体、下丘脑、脂肪和肝脏组织中,而ERβs 主要在卵巢、前列腺和脑中表达(Shughrue 等,2000 ;Couse 等,1997)。在金 鱼、倒刺鲃、许氏平鲉、尼罗罗非鱼、虹鳟等硬骨鱼中,ERα 主要分布在性腺、 肝脏、心脏及垂体等组织,而ERβs 则主要在性腺、垂体、肾脏等组织 (Choi 等, 2003 ;Zhu 等,2008 ;Shi 等,2011 ;Mu 等,2013 ;Wang 等,2005 ;Nagler 等, 2000 ),暗示了在硬骨鱼性腺发育过程中不同亚型雌激素受体的发挥不同的作用 (Zhu 等,2008 )。 9 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 3.3 雄激素受体研究进展 在脊椎动物中,雄激素参与生殖系统的分化、发育、成熟和维持雄性第二性 征中起到重要作用,此外,在不同发育阶段发挥着不同的作用,是脊椎动物精子 发生的主要调节激素(郑新民等,2008 )。在雌性动物中,雄激素还起到抑制未 成熟卵母细胞向成熟细胞和正常胚胎转化的作用(Cheng 等,2002 )。已有研究 发现,在硬骨鱼中,雄激素睾酮(testosterone ,T )能够促进性腺发育成熟以及 性转化(Crim 等,1983;舒琥等,2006 ;Kuo 等,1988),是一种重要的性类固 醇激素。与雌激素相似,雄激素的这些生理作用同样需要特定的核雄激素受体 (androgen receptor,AR )来介导。AR 是核受体超家族成员之一,是一种配体 依赖的反转录调节蛋白。 AR 一般由四个功能结构域组成,包括 (1)由第一个外显子编码的位于N- 端的转录激活区 (N-Terminus domain,NTD ),其保守性较低,包含一个转录激 活区AF-1,参与AR N-端和C-端的相互作用,与转录激活有关;(2 )DNA 结合 域 (DBD-binding domain ,DBD ),该区有由8 个保守的半胱氨酸残基组成的两 个锌指结构,主要介导受体与靶基因的结合,并引发靶基因进行有效转录,该区 与其它类固醇激素受体有较高的同源性;(3 )易变的铰链区,研究显示,该区影 响AR 的核定位目标,删除该区域可使配体诱导的转录效率明显降低(Simental JA 等,1991);(4 )位于C-端的配体结合区 (Ligand binding domain ,LBD ),该区 高度保守,包含一个核定位信号、一个二聚体化区域、与热休克蛋白相互作用的 区域和一个配体依赖的转录激活区AF-2 ,主要参与与配体的特异性结合 (Gelmann,2002 ;Kumar 等,2004 )。 随着两栖类和真骨鱼类(有颌类)核受体基因序列的分离,人们对类固醇激 素受体的研究也越来越深入。鉴于雄激素在体内的重要生理意义,对雄激素受体 的报道越来越多。研究发现,在一些哺乳动物、两栖类和硬骨鱼类中发现了两种 型式的AR 基因。自1993 年在非洲爪蟾(Xenopus laevis )(Fischer 等,1993) 中成功克隆得到AR 基因的亚型,分别由不同基因所编码,命名为ARα 和ARβ , 随后在一些硬骨鱼中,如日本鳗鲡(Anguilla japonica )(Ikeuchi 等,1999)、细 须石首鱼(Micropogonias undulatus )(Sperry 等,1999)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss )(Takeo J 等,1999)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus )(未发表,登 10 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 录号分别为AF121257 和AY082342 )、食蚊鱼(Gambusia affinis)(Song 等,2005 )、 伯氏朴丽鱼 (Haplochromis burtoni )(未发表,登录号分别为AB045211 和 AB045212 )等均发现两种型式的AR 基因,而在黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii ) (He 等,2003 )、真鲷(Chrysophrys major)(Touhata 等,1999)和鲤科鱼类 (Cyprinidae ),如斑马鱼(Danio rerio )(Mohammad 等,2008 )、倒刺鲃(Spinibarbus denticulatus )(Liu 等,2009 )、金鱼(Carassius auratus )(未发表,登录号为 AY090897 )中均只发现一种型式的AR ,且均与ARβ 更为相似。有专家推测, 在进化过程中,这些鱼类可能保留了一个有功能的AR 来行使其它鱼类的两个 AR 的功能(黄宝锋,2008 )。 研究表明,硬骨鱼类的两种AR 具有不同的组织表达模式,其组织分布和在 组织中的表达量存在很大区别。在细须石首鱼中,ARα 主要在脑中表达,而ARβ 在两性的脑和性腺中均有发现(Sperry 等,1999);虹鳟ARα 较ARβ 的表达更 广泛,且两者在精巢中的表达水平高于卵巢(Takeo 等,1999);日本鳗鲡的研 究结果显示,ARα 在各组织中都有表达,而ARβ 只在脾脏、精巢和肌肉中检测 到表达。有些硬骨鱼中只发现一种型式的AR ,据道报,这些物种的AR 组织分 布也不尽相同。如在斑马鱼(Mohammad 等,2008 )、南方鲇(黄宝锋,2008 )、 倒刺鲃 (Liu 等,2009 )中,雄鱼各组织中均有表达,而舌齿鲈(Dicentrarchus labrax )(Blázquez 等,2005 )雌、雄鱼中AR 仅在性腺、脑、肝脏等组织中检测 到表达。目前,国内外对绿鳍马面鲀AR 的分子生物学研究尚未见报道。 4.本研究的目的和意义 绿鳍马面鲀是我国重要的经济鱼类。由于自然资源严重衰退,现已不能满足 国内外市场的需求,导致市场价格明显提高。近年来,我国陆续开展了对绿鳍马 面鲀人工养殖和苗种繁育的相关研究,但对其繁殖生理学相关的报道仍不多见。 本文以人工养殖绿鳍马面鲀为研究对象,克隆得到了三种ERs 基因和AR 基因的 核心序列,并分析了各基因的组织分布和在性腺发育周期表达模式,结合血清中 性类固醇激素水平的周年变化和ERs 、AR 在性腺中的定位,来揭示这两类受体 在绿鳍马面鲀雌鱼、雄鱼中的生理机制。通过该项研究,在理论上丰富硬骨鱼内 分泌研究内容,在实践上为绿鳍马面鲀的生殖调控和发育提供科学依据。 11 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 第二章 绿鳍马面鲀雌激素受体α 和雄激素受体在性腺组织 中的定位 性类固醇激素(Steroid hormone)在调节脊椎动物的下丘脑-垂体-性腺(HPG ) 轴的发育成熟及功能的维持起着至关重要的作用(Fink 等,1988;李文笙等, 2000 )。性类固醇激素主要包括雌激素和雄激素(林浩然,1999),研究表明,无 论雌性还是雄性,其体内都存在一定比例的两种激素,它们在体内可以相互转化, 促进性腺的发育成熟(方永强等,2001 ),其作用的发挥是通过其受体ER 和AR 介导来实现。 目前,国内外报道了一些鱼类的脑、垂体、性腺中性类固醇激素及其受体的 定位,涉及到文昌鱼(Branchiostoma belcheri )(方永强等,2001 ;方永强等, 2003 )、鲻鱼(Mugil cephalus )(翁幼竹等,2003 ;方永强等,2003 )、半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis )(温海深等,2010 )等,然而,对性成熟绿鳍马面鲀性 类固醇激素,主要包括ER 和AR 在性腺组织中的定位研究尚未见报道。 本研究以性成熟绿鳍马面鲀性腺为对象,采用免疫组织化学方法,对ERα 、 AR 在不同性腺发育期中的表达情况进行研究,并以激素和受体之间的关系为依 据,深入了解绿鳍马面鲀的性腺发育机制,寻找其生殖活动的特点及规律,为证 明绿鳍马面鲀性类固醇激素参与调节性腺发育成熟提供形态学依据,也为进一步 阐明绿鳍马面鲀ERα 和AR 的生理功能提供组织学和生理学依据,更为其资源 的开发和人工繁育提供一定的理论基础。 1.材料与方法 1.1 实验用鱼 实验用人工养殖绿鳍马面鲀,于2010 年11 月至2011 年9 月,在烟台百佳 水产有限公司每2 个月采集一次,共采样6 次,每次采样用于本实验的有3 尾雄 鱼和3 尾雌鱼,共36 尾。实验鱼规格为体长20.0~29.5cm ,体重195.5~648.8g 。 1.2 样品采集 测量绿鳍马面鲀的体长(吻端到尾鳍根部)和体重。实验鱼麻醉后进行尾静 脉采血,并于4 ℃冰箱静置4-8h,16000rpm 离心10min,并吸取血清,于-40 ℃ 12 万方数据 绿鳍马面鲀性类固醇激素受体在生殖周期中的表达机制 冰箱中冷冻保存。采血完成后,取性腺进行称重,并取小块浸入Bouins 氏液固 定。之后迅速解剖鱼体,称取鱼体净重。 1.3 主要仪器和试剂 实验主要仪器: LEICA-RM2016 切片机;KEDEE-KD-T 生物组织摊片机;烘 箱(54-56℃);OlympasCX21FSI 显微镜;免疫组化笔;温盒等;滤纸。 实验主要试剂:ERα 一抗,为兔抗鱼17β-雌二醇(17β-E )(武汉博士德公 2 司合成,1:50 稀释);AR 一抗,为兔抗人多克隆抗体(购自武汉博士德公司, 1:50 稀释);SABC 免疫组化试剂盒,包括5% BSA 封闭液、羊抗兔IgG (二 抗)、DAB (3’,3’-二氨基联苯胺)显色剂;1%多聚赖

  GB T 32610-2016_日常防护型口罩技术规范_高清版_可检索.pdf